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宏基因组测序是一种利用高通量测序技术完成微生物群落所有物种基因组的检测和功能分析的方法。宏基因组测序技术无需微生物的分离纯化培养，能够快速有效地获得整个微生物群落的基因信息，可以更加深入地对群落结构、物种分类、系统进化、基因功能及代谢网络等方面进行研究。

应用领域

1、群落微生物物种分类

2、群落功能分析

3、未知物种鉴定

技术路线

分析内容

标准信息分析

1. 测序质量评估与数据过滤

2. 过滤宿主数据（若有宿主）

3. 宏基因组组装

4. 组装结果统计与评估

5. 物种注释及物种丰度统计

物种分布堆叠图

物种分布circos图

物种分布热图

6. 基因预测

7. 基因丰度分析

8. Core-pan曲线分析

9. 基因数据库功能注释

KEGG、eggNOG、CAZy、PHI、CARD、VFDB

10. 基因功能丰度热图、柱形图、circos图

11. 多样品间比较分析（基于各物种分类、功能分类）

a) 组间比较韦恩图

b) 组间比较upset图

c) 样本关系热图

d) UPGMA聚类树分析

e) PCA分析

f) PCoA分析

g) NMDS分析

h) Adonis检验

i) Anosim检验

12.差异分析（基于各物种分类、功能分类）

a) Welch’s T-test组间差异分析

b) Anova组间差异分析

c) 物种富集三元图

e) Metastates分析

f) Lefse分析

定制化信息分析

1. binning分析

2. CAG分析

3. 肠型分析

4. SEM结构方程分析

样品要求/项目周期

请咨询当地销售或拨打电话：020-84889324（医学）、020-84889314（农学）了解详情。

参考文献

[1] Zhu CM, Zhang JY, Guan R, et al. Alternate succession of aggregate-forming cyanobacterial genera correlated with their attached bacteria by co-pathways. Sci Total Environ. 2019;688:867‐879. doi:10.1016/j.scitotenv.2019.06.150

[2] Liang J, Mao G, Yin X, et al. Identification and quantification of bacterial genomes carrying antibiotic resistance genes and virulence factor genes for aquatic microbiological risk assessment. Water Res. 2020;168:115160. doi:10.1016/j.watres.2019.115160

Q1：宏基因组测序是否需要生物学重复？

A：可以不设置重复，但是这类型的文章一般有其他分析加以辅助（例如扩增子测序分析）。如果只是单纯做宏基因组研究，建议设重复，因为微生物的组成波动性比较大。

Q2：宏基因组binning的分析什么样本都能做吗？有什么要求？

A：数据量大比较好。20G以上的数据量即可进行。

Q3：怎么从宏基因组的结果中找到关注的目标功能基因？

A：可以根据关注的目的针对不同的数据库来筛选目标基因。例如：如果关注致病性相关基因，可以优先查看CARD（Comprehensive Antibiotic Resistance Database）综合抗生素耐药性数据库、VFDB（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria）毒力因子数据库、PHI-base（Pathogen Host Interactions）病原宿主互作数据库的注释结果。

宏基因组测序探讨自闭症与肠道微生物的关联

合作单位：南京医科大学

发表期刊：2020 Gut microbes

影响因子IF：7.823

研究背景

自闭症谱系障碍是儿童精神类疾病中最为严重的一种，其中胃肠功能失调（便秘）是伴随产生的最普遍的核心症状。因此，研究探讨自闭症与肠道微生物的关联，为自闭症可能的微生物诊疗方案提供参考。

实验方法

1）前期16S初探：143位自闭症儿童（ASD）和143位同年龄的典型发育儿童（TD），粪便样本16S V4区测序。

2）宏基因组深入：从286位个体中挑选30位有便秘症状的儿童（C-ASD）和30位同年龄、性别的典型发育儿童（TD），粪便样本宏基因组测序。

3）代谢物表型关联：C-ASD与TD粪便样本，LC/MS代谢组分析。

研究思路

图1 研究思路

研究结果

1. 大样本量的微生物特征整体分析-16S

基于16S进行大样本量的微生物特征初步分析。在物种多样性层面，TD组有173个特有的OTU，ASD组有67个特有OTU。在菌群结构层面，基于OTU水平的Bray-curtis距离（图2）、（un）weighted UniFrac距离的PcoA分析都表明，TD和ASD的菌群结构有显著差异，并且ASD组内的菌群结构差异更大（点分布更为离散）。

Lefse分析

Lefse分析发现，门水平，ASD组变形菌门和放线菌门的丰度显著增加，拟杆菌门显著降低；属水平，ASD组小类杆菌属、希氏大肠杆菌属、双歧杆菌丰度显著增加，而普氏菌属9、巨单胞菌属, 瘤胃球菌属2丰度显著降低。

图2 OTU的Bray距离PCoA散点图

图3 各组内属水平物种相关性网络图

Spearman物种间网络图分析

基于属水平分析，筛选各分组内至少在10个样本中存在的物种，计算组内两两物种间的spearman相关系数，按相关性≥0.25且显著性＜0.05为阈值，筛选满足的关系对绘制物种间网络图。

如图3，节点表示物种，颜色表示门水平的注释，红线和绿线分别表示正相关和负相关。结果表明，两组的网络关系都主要存在于Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria、 Actinobacteria、Fusobacteria的5个门中。但是，TD组物种间的正相关作用更强（红线居多），而ASD组网络更为复杂。

随机森林分析

为提供疾病诊断的参考，获得ASD的潜在指示物种，研究基于在95%以上样本中存在的属水平物种，进行了随机森林分析（图4），图中横轴表示mean decrease accuracy，数值越大表示物种的指示作用更强，最终获得24个指示物种，柱子颜色表示物种在那个分组中丰度更高。

图4 属水平水随机森林分析

图5 Netshift指示物种分析

2.“小样本量”的微生物特征深入分析-宏基因组

在16S水平主要是大范围的门、属的物种分析，结果暗示了非常强的物种与疾病的关联。因此研究基于宏基因组，开展小范围内更深入的分析，因此是基于更精细的种水平和物种基因功能进行探究。

为了使小范围的疾病样本分析更具有代表性，研究筛选了特征性更强的（即已经具有便秘症状）的自闭症儿童（C-ASD）进行宏基因组分析。

物种分析

在种水平，PCoA分析表明该水平的物种结构有显著差异。TD组和C-ASD组分别鉴定获得237,828、214,357个特有物种。Wilcoxon秩和检验鉴定出138个显著差异物种，基于种水平物种网络图，使用Netshift算法鉴定C-ASD的“驱动”物种，即在物种网络由健康到疾病的转化过程中，有重要驱动影响作用的物种。

功能分析

宏基因组分析共鉴定获得1,550,192个unigene。基于KO（KEGG level D层级）的ANOSIM分析表明，TD与C-ASD的基因组成存在显著差异；基于pathway（KEGG level C层级）的PCoA分析表明分组的代谢通路组成也存在显著差异。KO和pathway的Wilcoxon秩和检验和Lefse分析（图6）均鉴定到了大量的显著差功能。同时研究还基于eggNOG、CAZy、ARDB 3个数据库开展功能对比分析，结果都表明了C-ASD的功能差异，暗示肠道菌群功能失调严重。

图6 功能差异Lefse分析

图7 代谢组OPLS-DA分析

3. 粪便代谢组分析

OPLS-DA（图7）表明两组代谢物丰度分布有显著差异，wilcoxon秩和检验鉴定获得17个显著差异代谢通路。有37个代谢物丰度变化超过2倍。

4. 物种与代谢物关联分析

为进一步阐明肠道微生物与ASD的密切关联，研究开展了物种与代谢物的关联分析。基于高丰度的top45个种和显著差异的代谢物，计算spearman相关系数（图8），结果表明Ruminococcus lactaris、Alistipes spp.、Oscillibacter sp. ER4、Faecalibacterium sp.CAG:74与dihydrojasmonic acid、butanone、hexanoic acid、flunitrazepam、fospropofol、 caprolactone存在显著正相关。

一方面Ruminococcus lactaris也是上文分析鉴定的疾病驱动物种，另一方面这些显著正相关的代谢物是神经递质代谢通路上的重要中间化合物。

图8 物种与代谢物关联分析

小结

研究思路清晰完善，将微生物与ASD的关联解析逐级深入。首先是大样本量16S在门和属水平的初步探讨，然后是小样本量宏基因组在种和功能水平深入分析，最后是代谢水平表型特征讨论，并通过宏基因组与表型的关联分析进一步验证深化。

参考文献

Dan, Zhou, et al. "Altered gut microbial profile is associated with abnormal metabolism activity of Autism Spectrum Disorder." Gut Microbes (2020): 1-22.